目的:研究小鼠胚胎干细胞(ES细胞)定向诱导分化为神经样细胞后5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε的表达变化,探讨可能涉及ES细胞定向分化的信号通道。
方法:ES-BALB/c细胞株用无mLIF的ES细胞培养液培养4天,形成胚胎体,再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10M视黄酸(RA)诱导后,用nestin和NF-200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后第1、3、5、7和14天用Western印迹方法来检测PKC亚型表达变化,并观察了PKC激活剂佛波酯(PMA)和PKC抑制剂D-鞘氨醇对它们表达的影响。
结果:诱导前免疫组化发现PKC。在ES-BALB/c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞核最甚;而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达,nestin和NF-200不表达。Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带,分子质量约为84kd;而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型无蛋白印迹条带;诱导后免疫组化发现PKC。表达减弱,其它4种亚型仍无表达,nestin和NF-200诱导第3天后开始表达,第7天达到高峰;Western印迹显示PKCα表达量急剧下降,以后逐渐升高,至第14天恢复至正常。其它4种亚型仍无蛋白表达。PMA可使PKCα在诱导后细胞中的表达增强,而D-鞘氨醇的作用相反,使它们的表达明显降低。
结论:在ES细胞定向分化为神经样细胞中通过PKCα有非常重要的调控作用,而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型可能没有参与ES细胞的定向分化。