目的:探讨绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞(GFP-ESCs)源性视网膜样干细胞与海马源性神经干细胞(NSCs)的培养条件与分化特性的异同点,以便为青光眼等视神经视网膜退行性疾病的细胞移植治疗提供更佳的种子细胞。
方法:将拟胚体阶段视黄酸及视网膜Müller细胞诱导的GFP-ESCs和自60只BALB/c胎鼠海马组织分离的细胞(每次实验取10只),分别在NSCs选择性培养基中进行培养筛选,观察细胞形态变化,RT-PCR法检测Nestin基因表达,BrdU整合能力,免疫细胞化学法检测Nestin等NSCs特异性标志物,对其分化后细胞检测Map2、Gap43、NF200、S100、GFAP神经组织细胞标志抗原。将ESCs诱导后视网膜样干细胞与胎鼠海马源性NSCs的培养与分化特性进行比较,用RT-PCR法比较nestin mRNA表达,免疫细胞化学法检测分化后细胞NF200阳性神经元和GFAP阳性胶质细胞比例。
结果:初级诱导的ESCs及海马细胞,在NSCs选择性培养基中培养,均形成表达Nestin mRNA及抗原的神经球样结构,整合BrdU,具有体外扩增传代及分化为神经元及神经胶质样细胞的能力。两者比较,ESCs源性视网膜样干细胞来源更加方便,可在贴壁及悬浮两种状态下生长,有较强的保持未分化状态并进行体外培养扩增的能力;而海马源性NSCs取材受限,原代培养操作繁琐,分离效率低,神经球只能呈悬浮态生长,贴壁后即使在NSCs培养基中也极易分化,较难维持未分化状态下大量扩增。培养7d的ESCs源性及海马源性神经球细胞均可见nestin mRNA表达,但前者表达高于后者。ESCs源性视网膜样干细胞分化细胞中NF200阳性细胞占 42.1±3.6%,GFAP 阳性细胞占45.4±2.7%;与海马源性NSCs分化细胞(NF200 18.7±5.1%,GFAP 66.3±14.5%)相比有显著性差异。
结论:GFP-ESCs源性视网膜样干细胞比海马源性NSCs均具有NSCs的基本特性,但前者来源更加方便充足,有更强的扩增能力和向神经元分化的潜能,可作为干细胞移植治疗青光眼等神经变性疾病研究新的种子细胞。