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| 炎症对培养人视网膜微血管内皮细胞PDGF-B和Tie-2表达的影响 |
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作者：刘洪雷 … 文章来源：西安 第四军医大学西京医院眼科， 710032 点击数：2349 更新时间：2005/6/29 13:59:22 
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| 目的
1.建立体外采用CD31免疫磁珠进行微血管内皮细胞的培养方法。
2.探讨人视网膜微血管内皮细胞免疫组化特征。
3.研究不同浓度TNF-α对人视网膜微血管内皮细胞PDGF-B与Tie2的表达影响。
方法
1.人的视网膜用剪刀剪碎后，经Ⅰ型胶原酶消化，系列滤网或尼龙网过滤，人视网膜微血管内皮细胞采用CD31结合的磁珠分离与富集，人视网膜微血管周细胞由剩下的悬液收集，获得的人视网膜微血管内皮细胞采用明胶包被的培养皿添加内皮细胞生长培养基，人视网膜微血管周细胞采用20％胎牛血清的DMEM培养基；机械除杂非内皮细胞。
2.倒置显微镜下进行人视网膜微血管内皮细胞形态学及生长方式的观察；采用免疫组化荧光双标记分别评价内皮细胞特异免疫组化特征，激光共聚焦显微镜下观察结果；采用MTT法对人视网膜微血管内皮细胞进行生长曲线测定；细胞活力（％）采用台盼蓝拒染活力实验进行。
3.人视网膜微血管内皮细胞分别暴露于不同剂量的TNF-α，采用免疫组化、Western blotting和RT-PCR研究Tie-2和PDGF-B的表达。
结果
1.采用CD31免疫磁珠进行纯化的改良方法成功的收集了充足数量的人视网膜微血管内皮细胞，采用通过系列尼龙网的经典方法进行了人视网膜微血管周细胞的分离。
2.原代培养的人视网膜微血管内皮细胞开始呈细长形状，通常是纺锤样，细胞生长呈片状时，是多边形、近圆形。人视网膜微血管内皮细胞表达vWF和细胞粘附蛋白CD31、CD34，并不包含α平滑肌肌动蛋白；第一抗体采用PBS以及血清替代的阴性对照组抗体均未着色。人视网膜微血管内皮细胞和周细胞的生长曲线近呈倒“S”形；人视网膜微血管内皮细胞3~5天后进入对数生长期，约8～9天后进入平台期，出现接触抑制。人视网膜微血管内皮细胞的活力约87～90％；液氮冻存后人视网膜微血管内皮细胞的活力约85～87％。
3.半定量RT-PCR结果显示，与对照组相比，常规TNF-α剂量组（100ng/ml）在12h人视网膜微血管内皮细胞 PDGF-B表达分别上调1.7倍；大剂量TNF-α（2450ng/ml）组，与对照组相比，PDGF-B和Tie-2出现戏剧性的下调，8 h表达开始出现下调，在12 h PDGF-B的表达量为原来的39％，Tie-2的表达为原来的48％；
结论
1.采用免疫磁珠方法以人视网膜为材料成功进行了人视网膜微血管内皮细胞和周细胞的原代培养，首先报道应用免疫磁珠分离、富集人视网膜微血管内皮细胞的方法。
2.原代培养的人视网膜微血管内皮细胞形态学以及免疫组化证实，此法培养的细胞纯度分别为95％。
3.首次报道大剂量的TNF-α能够显著下调PDGF-B与Tie2以及PDGFR-β与Ang-1的表达，可能与DRP早期周细胞的丢失高度相关，可能在DRP发病机制中起到始动作用；常规TNF-α剂量能够上调PDGF-B与Tie2的表达，可能导致视网膜新生血管形成。
这为糖尿病视网膜病变发病机制的进一步研究及其防治打下了基础。
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| 会议投稿录入：aya610 责任编辑：毛进 |
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