| 目的 增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR） 是眼组织对创伤修复反应的一种过度增殖的结果，其基本病理过程是原发性视网膜脱离或眼球穿通伤后的炎症反应,宿主细胞的游走、增生、膜形成,增生膜与视网膜粘连和收缩,形成对视网膜的牵拉,引起牵拉性视网膜脱离。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的迁移、增殖可启动PVR的形成，并且对PVR疾病中增殖膜形成具有重要作用。尽管玻璃体视网膜手术已取得长足进展, 但手术并不能有效阻止细胞的迁移、增生, 因此结合药物防治PVR 受到广泛关注。近期PVR的研究热点是借助细胞凋亡途径控制细胞的增殖，施加凋亡诱导剂，使迁移的细胞发生凋亡。随着分子生物学技术的发展，从凋亡途径抑制RPE细胞的增殖、迁移，诱导RPE细胞，为治疗PVR提供新的途径。本研究应用钙通道拮抗剂-维拉帕米（Verapamil，Ver）作用于体外培养人RPE细胞，诱导其凋亡，并对凋亡过程中的信号转导途径作一探讨。
方法 原代培养人RPE细胞，2-6代用于本实验。应用80mg/Lver作用体外培养人RPE细胞12、24、48小时，MTT法检测Ver对RPE细胞增生抑制率；吖叮橙（AO）荧光染色法、透射电镜、流式细胞术法检测Ver诱导 RPE细胞凋亡； Fluo-3/AM负载技术检测凋亡过程中RPE细胞内钙浓度的变化；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、细胞免疫组织化学、蛋白印记法（Western-blot）检测凋亡抑制基因Bcl-2以及Caspase-8、Caspase-3的表达。
结果 1处于对数生长期的HRPE细胞经80mg/Lver作用不同时间后，细胞数明显减少， RPE细胞生长明显抑制，12、24、48h细胞增生抑制率（%）分别为13.55±3.91、16.71±5.31、42.34±2.53，组间比较，差异有显著性（F=170.1797，P＜0.01＝，随着药物作用时间延长，HRPE细胞生长抑制明显，48h抑制率最高。2荧光显微镜下，未加药组AO染色的HRPE细胞呈梭形，细胞质呈红色荧光，细胞核呈绿色均匀荧光，可见深染细胞核核仁经80mg/Lver作用后，可见凋亡细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞核内可见致密浓染的黄色荧光。Ver作用48h后的凋亡细胞数量比24h的明显增多，贴壁细胞明显减少，而作用12h的细胞与未加药组细胞比较无明显变化。3 透射电镜下，正常HRPE细胞超微结构见细胞核膜完整，染色质均匀分布。作用24h时，细胞核内出现染色质边集及染色体固缩，电子密度增强，细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内细胞器保存较好，细胞浆内可见空泡增多，细胞膜保存完整，可见细胞膜芽生出泡现象。48h时可见核染色质浓缩和细胞膜芽生出泡。4流式细胞仪检测结果， Ver作用12h时，G0/G1期前可亚二倍体峰，24、48h亚二倍体峰逐渐增高。Ver作用12、24、48h的凋亡率（%）分别为8.21±1.20﹑16.14±4.60﹑23.93±3.63，组间比较，差异有显著性意义（F=12.3415 P<0.05）,随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。5正常HRPE细胞显示Ca2+荧光分布，胞核荧光最强，胞浆次之。Ver,正常RPE细胞及Ver作用RPE细胞12、24、48h时[Ca2+]i（nmol/L）分别为197.25±29.03、176.09±25.88、156.45±20.60、135.28±21.18，组间比较，具有显著性差异（F=23.607 P＜0.01＝。 6 RT-PCR显示，Bcl-2表达逐渐下降，与免疫组化结果一致。而Caspase-8未见有表达，Caspase-3表达增强，与Western-blot结果一致。
结论：一定浓度的Ver可抑制体外培养的人RPE细胞增生，并诱导RPE细胞凋亡；凋亡过程中RPE细胞内钙浓度呈下降趋势，可能钙离子浓度变化是RPE细胞凋亡的关键信号；凋亡过程中Bcl-2表达下降，同时caspase-3表达增强，本实验条件下，未见有caspase-8的表达。
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