| 视神经保护药物筛选体系的建立
首都医科大学附属北京同仁医院 马科
建立细胞培养初步筛选，动物实验进一步筛选，并探讨作用机制的方法，方法如下：
一、 初步筛选：离体8小时内人视网膜，制成3×106个/ml细胞悬液，用IMDM培养液CO2培养箱中培养，10天时做细胞鉴定，90%为神经细胞。MTT法观察细胞活性。筛选出有效药物有EGb 761、葛根素、中药复方1、中药复方2等，该种方法用于初步筛选视神经保护药物。
二、 进一步筛选：
1． SD大鼠视神经夹伤模型，40克微型视神经夹距离球后2mm夹伤视神经60秒。采用3% Fluoro-gold逆行标记，CPAS软件计数RGC，以RGC存活率为指标观察药物的有效性。以EGb761为例，对照组RGC存活率为60.59%，EGb761组为71.60%，两组之间差异具有显著性，提示EGb761对RGC有保护作用。
2． SD大鼠急性高眼压缺血再灌注模型：对大鼠右眼加压到110mmHg 60分钟， 4周后观察，对照组RGC存活率为64.09%，EGb761组为75.14%，提示EGb761对RGC有保护作用。
三、 作用机制研究
1． 对细胞凋亡的作用：培养人视网膜细胞经Annex Ⅴ和PI双重染色，用流式细胞仪检测。以EGb761为例，该药物对视网膜神经细胞凋亡有明显抑制作用。
2． 对线粒体膜电位的影响：培养人视网膜神经细胞用Rhodamine123染色，激光共聚焦生物显微镜检测，结果显示EGb761可以提高MMP。
3． 对细胞内游离钙的影响：培养人视网膜神经细胞用Fluo-3染色，激光共聚焦扫描显微镜检测，结果显示EGb761可以抑制细胞内游离钙的增加。
通过上述方法，可以筛选出有效的视神经保护药物，特别是中药成分，为进一步的临床研究提供可靠依据。
|
